傳統(tǒng)化學(xué)方法，無法準確定量，怎么辦？

示差檢測器，蒸發(fā)光檢測器，靈敏度低，滿足不了檢測限要求，怎么辦？

LC-MS，價格昂貴，適用范圍窄，怎么辦？

在整個藥品研發(fā)過程中，產(chǎn)品雜質(zhì)研究是至關(guān)重要的一環(huán)，一些特殊雜質(zhì)的檢測往往會成為項目開展的限速步驟！成為困擾大家的絆腳石！

對于一些無紫外吸收的雜質(zhì)，無法采用紫外檢測器進行常規(guī)檢測，傳統(tǒng)化學(xué)顯色方法無法準確定量；通用檢測器靈敏度往往達不到要求；LC-MS、GC等儀器價格較貴，且對化合物種類有一定限制。今天，給大家介紹幾種柱前衍生化法，或許可以為你提供新思路，助你解開難題！

（一）柱前衍生化法介紹

無紫外吸收或紫外吸收很弱的物質(zhì)與帶有發(fā)色基團或電化學(xué)活性基團的衍生化試劑反應(yīng)，生成穩(wěn)定的、具有紫外吸收的物質(zhì)，可通過液相色譜（紫外檢測器）進行檢測的方法。

優(yōu)點：

1.對用作流動相的溶劑體系沒有限制；

2.反應(yīng)條件、反應(yīng)速率不受限制；

3.通過選擇合適的試劑以及萃取方法，消除干擾；

4.過量溶劑、試劑容易除去；

5.轉(zhuǎn)變成合適的衍生物，可使分離度改進。

缺點：

1.操作過程繁瑣，容易影響定量準確性；

2.復(fù)雜組分樣品衍生化反應(yīng)后，有可能產(chǎn)生多種衍生化產(chǎn)物，

給色譜分離帶來困難；

3.有時重現(xiàn)性不佳，不易連續(xù)化。

（二）常用的紫外衍生基團/試劑

（三）常見的衍生方法

1）對甲苯磺酰氯可與伯胺和仲胺反應(yīng)

反應(yīng)特點：

①伯胺和仲胺可與對甲苯磺酰氯反應(yīng)，叔胺不與對甲苯磺酰氯反應(yīng)；

②伯胺與對甲苯磺酰氯反應(yīng)生成的對甲苯磺酰胺化合物易溶于堿性溶液；

③仲胺與對甲苯磺酰氯反應(yīng)生成的對甲苯磺酰胺化合物不溶于堿性溶液；

反應(yīng)優(yōu)點：水浴55℃，水浴30min時能達到較高的衍生化效率，對甲苯磺酰胺化合物紫外響應(yīng)極強，穩(wěn)定性高，最大吸收波長229nm。

2）2，4 - 二硝基苯肼（DNPH）與羰基化合物（醛類和酮類中的羰基）反應(yīng)

反應(yīng)優(yōu)點：在酸性條件下，在水浴60℃，水浴20分鐘時能達到較高的衍生化效率。

3）苯甲醛/對二甲基苯甲醛與肼反應(yīng)生成苯甲醛吖嗪/對二甲氨基芐連氮黃色化合物

反應(yīng)優(yōu)點：20分鐘即可反應(yīng)完全，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高。

案例分享
1）案例一

研究思路：起始原料TGR-1D制備過程中可能會引入某致突變雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)與TGR-1D相似，考慮將TGR-1D按照致突變雜質(zhì)進行研究，TGR-1D無紫外吸收，GC/GC-MS等都無法達到目的，因此考慮采用對甲苯磺酰氯與結(jié)構(gòu)中的伯胺進行柱前衍生，采用HPLC進行測定。

衍生方法：水浴55℃，衍生30分鐘。衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，229nm有最大吸收。

結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗證，方法穩(wěn)定，衍生效率高，LOQ為0.36ng，為致突變雜質(zhì)研究及無紫外吸收雜質(zhì)研究提供一種研究思路。

2）案例二

研究思路：需要對起始原料乙醇胺進行研究，該化合物無紫外吸收，GC響應(yīng)較弱，結(jié)構(gòu)為伯胺，考慮采用對甲苯磺酰氯衍生生成對甲苯磺酰胺化合物，引入較強共軛，可采用HPLC進行測定。

衍生方法：水浴55℃，衍生60分鐘。衍生產(chǎn)物穩(wěn)定，229nm有最大吸收。

結(jié)論：經(jīng)方法學(xué)驗證，方法穩(wěn)定，衍生效率高，LOQ為0.04ng，為無紫外吸收雜質(zhì)研究提供一種研究思路。

藥物研發(fā)過程中，對于一些無紫外吸收的雜質(zhì)研究，可有多種方法，如GC、GC-MS/MS、LC-MS/MS、蒸發(fā)光檢測器（ELSD）、電噴霧檢測器(CAD)、柱前衍生等方法，各自方法均有優(yōu)缺點。對于結(jié)構(gòu)中有明顯可衍生基團情況下可優(yōu)先考慮衍生，但須兼顧其他雜質(zhì)及主成分的干擾，另外需要兼顧檢測成本，綜合選擇最優(yōu)的方法有利于日常研究及監(jiān)控。